PCR反應體系構建引物應遵循的原則

　　PCR(Polymerase Chain Reaction)反應體系是20世紀80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴增技術(shù)。具有易自動(dòng)化\特異、敏感、產(chǎn)率高、簡(jiǎn)便、快速、重復性好等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內將所要研究的目的基因或某一DNA的片段于在數小時(shí)內擴增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，使肉眼能直接觀(guān)察和判斷；或者可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細胞中，擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過(guò)去需要幾天甚至幾星期才能做到的事情，用PCR技術(shù)只需在幾小時(shí)以?xún)缺憧赏瓿?。PCR技術(shù)是生物醫學(xué)領(lǐng)域中的一項創(chuàng )舉和里程碑。

　　PCR反應體系構建中引物是特異性反應的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核昔酸鏈作引物，利用PCR就可將模板DNA在體外擴增。

　　PCR反應體系構建引物應遵循的原則：

　　1.引物長(cháng)度：15-30bp，常用為20bp左右；

　　2.引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其他序列無(wú)明顯同源性；

　　3.避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會(huì )形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶；

　　4.引物堿基：G+C含量以40％-60％為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過(guò)多易出現非特異條帶。ATGC一般隨機分布，避免5個(gè)以上的嚎吟或e陡核昔酸的成串排列；

　　5.引物3’端的堿基，特別是末及倒數第二個(gè)堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失??；

　　6.引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴增的靶序列一般要有適宜的酶切位點(diǎn)，這對酶切分析或分子克隆很有好處；

　　7.引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長(cháng)至10kb的片段。

　　引物量：每條引物的濃度0.1-1μmol/L或10-l00pmol/L，以Z 低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會(huì )引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會(huì )。